Dilahirkan di bandar Hartford, negeri Connecticut pada 12 Mei 1907, Hepburn ialah anak kedua dalam enam anak. Bapanya, Thomas Norval Hepburn (1879-1962) ialah seorang pakar urologi di Hospital Hartford. Ibu, Katharine Martha Houghton (1878-1951) merupakan seorang aktivis feminis. Ibu bapanya pada masa itu berjuang demi perubahan sosial di Amerika Syarikat. Bapanya membantu menubuhkan Persatuan Kebersihan Sosial New England untuk mendidik orang ramai tentang penyakit kelamin[1] manakala ibunya mengetuai Persatuan Hak Mengundi untuk Wanita Connecticut dan berkempen bersama aktivis, Margaret Sanger tentang kawalan kehamilan.[2] Hepburn pernah mengikuti ibunya ke beberapa demonstrasi "Undi Untuk Wanita" semasa kecil.[3] Anak-kanak keluarga Hepburn diasuh untuk melatih kebebasan bersuara dan digalakkan untuk berfikir dan berdebat atas topik yang mahu.[4] Ibu bapanya dikritik oleh masyarakat tentang pandangan progresif mereka, ini telah merangsang Hepburn untuk gagah melawan halangan yang dihadapi dalam kehidupan.[5][6] Hepburn menyedari bahawa sejak kecil beliau adalah hasil daripada ibu bapa yang "sangat luar biasa",[7] dan mengatakan pendidikan keluarganya "sangat bertuah" kerana menyediakan asas bagi kejayaan beliau.[8][9] Sepanjang hidup beliau kekal rapat dengan keluarga.[10]

Semasa muda, Hepburn seorang tomboy yang suka memanggil dirinya Jimmy dan memotong rambutnya pendek seperti anak lelaki.[11] Bapa mengajar mereka berenang, berlari, menyelam, menunggang, bergelut, dan bermain golf serta tenis kerana ingin anak-anaknya menggunakan minda dan tubuh mereka sampai had.[12] Golf menjadi kegemaran Hepburn, beliau pergi kelas setiap hari dan menjadi sangat mahir sehingga mencapai separuh akhir dalam Kejohanan Golf Connecticut Wanita Muda.[13] Beliau juga suka berenang di muara Long Island Sound; setiap pagi beliau akan mengambil mandi yang sejuk seperti ais dengan kepercayaan bahawa "lebih pahit ubat, lebih baik ia untuk awak."[14] Sejak usia muda, beliau seorang peminat filem dan akan pergi tonton satu filem setiap hari malam Sabtu.[15] Beliau juga mengadakan drama dan berlakon dengan rakan-rakan, adik-beradik untuk dipersembahkan kepada jiran-jiran dengan harga satu tiket 50 sen demi mengumpul duit bagi orang Navajo.[16]

Pada 3 April 1921, Hepburn menemui mayat abangnya Tom semasa melawati kawan-kawan di Greenwich Village, New York.[17] Tom yang dipujai oleh Hepburn kelihatan jelas adalah mati akibat pembunuhan diri kerana telah mengikat lembaran di alang lalu menggantung diri.[18] Keluarga Hepburn menafikan bahawa ia adalah kes bunuh diri dan menegaskan kematian Tom mesti satu eksperimen Tom yang tersilap.[19] Kejadian itu membuat Hepburn yang ketika itu remaja menjadi saraf, muram, dan sangsi terhadap orang lain.[20] Beliau menjauhkan diri daripada kanak-kanak lain, seterusnya menghentikan pelajaran Sekolah Kingswood-Oxford, dan mula menerima tunjuk ajar swasta.[21] Selama bertahun-tahun Hepburn menggunakan hari jadi Tom iaitu 8 November sebagai hari jadi sendiri. Hari jadi beliau hanya diketahui akhirnya semasa Hepburn mendedahkan tarikh lahir sebenar beliau dalam autobiografi Me: Stories of My Life (“Aku: Kisah Hidupku”) pada tahun 1991.

Pada tahun 1924, Hepburn mendapat tempat di Kolej Bryn Mawr. Hepburn tidak menyukai pengalaman di kolej ini[22] dan hanya belajar di sana kebanyakan untuk memenuhi hasrat ibunya sahaja yang pernah belajar di sana. Ini kali pertama beliau kembali ke persekolahan selepas beberapa tahun tidak berada di sekolah. Beliau mementingkan diri dan tidak selesa dengan rakan-rakan sekelas.[23] Beliau bergelut dengan kehendak akademik universiti dan pernah sekali digantung sekolah disebabkan merokok dalam bilik beliau.[24] Hepburn tertarik dengan perlakonan namun peranan drama kolej akan tertakluk sahaja jika gred baik. Hepburn pun mula berlakon secara tetap setelah mempertingkat markah beliau.[24] Pada tahun akhir kolej, beliau melakonkan watak utama dalam produksi drama The Woman in the Moon (“Wanita di Bulan”) dan sambutan positif yang diterima oleh beliau mengukuhkan rancangan beliau untuk mengejar kerjaya lakonan.[13] Beliau berkelulusan ijazah dalam bidang sejarah dan falsafah pada bulan Jun 1928.[25]